Рекомендации по работе с коньюгатами полимерной ПХ – стрептавидина (PolyHRP-SA)

Настоящие рекомендации ориентированы на людей, вовлеченных в процесс подготовки серийных диагностических наборов ИФА, а также проводящих входную сравнительную аттестацию сырья для производства ИФА наборов.  Рекомендации будут полезны и всем прочим пользователям настоящего продукта.

Применение настоящего продукта как высокоактивной ферментативной метки:

1.     ИФА (Иммуно-Ферментный Анализ)

2.     Иммуно-хемилюминесцентный анализ и все его модификации

3.     ДНК-гибридизация

4.     Иммуноблот

5.     Иммуногистохимия

 

Что нужно знать начиная работу с конъюгатом:

1.  Эффективность того или иного метода или диагностического набора зависит от многих факторов, в том числе совместимости большого числа компонентов. При замене большинства критических компонентов в диагностическом наборе часто бывает нужна оптимизация. В случае с коньюгатом PolyHRP-SA, такая оптимизация, как правило минимальна или не нужна – характеристики препарата очень близки к известному широко распространенному аналогу SP-80 фирмы SDT. Если в Вашем методе или наборе ранее не использовался препарат подобный PolyHRP-SA, то оптимизация может быть более глубокой.

2. Препараты PolyHRP-SA наиболее подходят для тест-систем, где существуют высокие требования к чувствительности, или к скорости проведения анализа (очень короткие времена инкубации).

3.  Всегда эффективнее сокращать время инкубации и наращивать концентрацию конъюгата нежели чем удлинять время инкубации при низкой концентрации конъюгата. 

4.   Эффективность настоящего продукта PolyHRP-SA, как и у его известных аналогов, сильно зависит от других компонентов системы анализа: стабилизаторов концентрата коньюгата или рабочих растворов в ИФА наборе. Компоненты в составе рабочих буферов могут приводить к появлению «шума» или подавлению сигнала. Дилюенты, потенциально содержащие эндогенный биотин, ингибиторы пероксидазы (азид натрия), хелатирующие агенты (ЭДТА), могут приводить к потере активности коньюгата.  В большинстве случаев, наиболее подходящим стабилизатором и блокиратором неспецифического взаимодействия для препарата PolyHRP-SA является казеинат натрия, полученный из казеина марки “vitamin free”. Влияние марки казеина и его формы очень значительно как для рабочих растворов так и для блокировки поверхности.

5. Рекомендованованные протоколы для работы с конъюгатом.

  • 100 mM Tris рН 8.0(±0,2),
  • 150-300mM NaCl,
  • 0,1% TritonX100,
  • 0,1-0,5% казеинат натрия (Sigma #C3400 / MP#901293 )

Важно:
поддерживать высокую ионную силу раствора: NaCl > 150мМ
0,01- 0,1% Тритон Х100 поможет убрать «шум»

 

Протокол приготовления 5% казеината натрия для рабочего буфера или для блокировки поверхности иммуносорбента или иного сорбента:

  • Ресуспендировать в 800 мл дистиллированной воды навеску 50 грамм казеина (Sigma #C3400 / MP#901293 ).
  • Внести в раствор навеску 13 грамм гидрооксида натрия (NaOH) (квалификации ОСЧ  или аналогичной)
  • Перемешивать до полного растворения (обычно 12-24 часа ), подогрев до +30-37С ускоряет процесс.
  • Нейтрализовать раствор концентрированной или разбавленной в несколько раз соляной кислотой до рН 8,5-9,5. В процессе внесения кислоты образуются агрегаты, которые растворяются при перемешивании. Вносить кислоту аликвотами.
  • Внести консервант (рекомендованный консервант совместимый с пероксидазой – Proclin300 или Proclin900). Азид натрия несовместим с пероксидазой! При отсутствии рекомендованных консервантов необходимо проводить исследование совместимости и стабильности.
  • Довести объем до 1 литра водой.
  • Хранение при +4С до 6 месяцев. Допускается выпадение осадка, возможно центрифугирование раствора при желании.

Протокол  приготовления блокирующего раствора для ИФА и других поверхностей:

  • К 100 мл раствора 5% казеината натрия внести навеску 50 грамм сахарозы.
  • Перемешать до полного растворения сахарозы, довести объем до 200 мл.
  • Хранение при +4С в течение 6 месяцев.

Казеин и блокирующий раствор на его основе рекомендован, так как это не дорогой белок, доступный в  хорошо очищенной форме, представлен фракцией белков и низкомолекулярных пептидов разных масс, от 10-20 до 60 кДа. Казеин является Ca-связывающим белком как и пероксидаза, поэтому они хорошо совместимы. Казеин является природным белком-стабилизатором, обладает хорошей стабильностью и адсорбирующей функцией.

5.    Наибольшую специфическую активность PolyHRP-SA проявляет непосредственно после приготовления рабочего раствора из 50% глицеринового стока или иного первичного концентрата.  Поэтому для научных исследований, где необходимо получить максимальную производительность, имеет смысл готовить рабочее разведение коньюгата непосредственно перед работой.

6. При подготовке к выпуску  промышленных серий ИФА диагностических наборов, в том числе при выборе оптимального рабочего титра коньюгата в конечном приложении, необходимо учитывать снижение активности коньюгата непосредственно после разбавления первичного концентрата в другом стабилизаторе.  Наблюдается некоторое падения активности препарата в течение нескольких часов после разбавления из первичного концентрата. Как правило падение составляет 10%, но может быть и большем в зависимости от Вашего дилюента/стабилизатора.

7. Активность разведенного в стабилизаторе коньюгата при +4…+8 С может снижаться при хранении в реальном времени до значения 60-70% (для методов с шейкированием)  от первоначальной активности препарата за 1 год. Рекомендуется предусмотреть падение активности компонента при настройке тест-системы.

Стандартный протокол работы с конъюгатом PolyHRP-SA при выборе рабочего титра и подготовке к выпуску серии готового компонента для производства ИФА диагностики:Приготовьте малые объемы предварительного разведения исходного концентрата PolyHRP-SA в Вашем стабилизаторе.

Пример:

Концентрат PolyHRP-SA поступил к Вам в 50% глицериновом стоке. Извлеките его из морозильной камеры. Приготовьте разведения в стабилизаторе: 1:20 ; 1:40 ; 1:60 и т.д. в произвольном порядке в зависимости от Ваших задач. Сразу после работы уберите концентрат PolyHRP-SA обратно в морозильное отделение..  

2. Используйте растворы немедленно для наивысшей активности или инкубируйте полученные разведения 10-20 часов для установления равновесия активности конъюгата.

3. Используйте полученные предразведения в своих приложениях как концентраты коньюгата, храните их при +4…+8С.

4.   На основании анализа полученных данных, выберите нужный рабочий титр PolyHRP-SA в стабилизаторе.

5.  Приготовьте большой объем концентрата коньюгата в нужном выбранном заранее титре. Уравновесьте раствор инкубацией 10-20 часов для выхода на стационарную активность.

6.   Компонент готов для анализа и дальнейшего розлива по флаконам в серию.